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라스단백질(Ras Protein)은 세포성장신호를 조절하는 중요 단백질로, 약 30%의 암 환자에서 돌연변이가 발생하는 것으로 알려지고 있습니다.

수 많은 거대 다국적 제약회사들은 지난 20년간 엄청난 투자를 통해 라스를 제어할 수 있는 항암제를 개발하고 있습니다.

라스가 암을 유발하려면 세포막으로 이동해야 한다는 점에 착안하여, 라스의 이동을 막아 활성을 억제하는 항암제를 개발하고자 시도하였지만, 임상실험에서 효과가 적고 부작용이 발생해 대부분 실패하였습니다.

최근 일부 항체 항암제들이 돌연변이 라스로 인한 암환자에게 효과가 없다는 사실이 밝혀짐에 따라, 라스를 제어하는 항암제 개발의 필요성은 더욱 절실해진 상황입니다.

이처럼 항암제 개발에 가장 큰 걸림돌로 알려진 라스단백질을 제어할 수 있는 새로운 원리가 규명됐습니다.

연세대 최강열 교수팀은 돌연변이가 발생해 기존 항암제로도 치료되지 않는 '라스'라는 암발생 인자를 제어할 수 있는 새로운 원리를 밝혀냈습니다.

최강열 교수팀은 라스단백질에 인산이 붙어 분해됨으로써 라스의 활성도 제어할 수 있음을 명확히 규명해 신개념 라스제어 항암제 개발의 단초를 열었습니다.

최 교수팀은 세포의 성장조절 신호전달체계인 윈트신호 전달계를 저해시키는 인자인 인산화 효소(GSK3beta)가 윈트신호를 억제하여 라스를 인산화시키고, 인산화된 라스에 단백질 복합체(베타티알시피-E3라이게이스)가 결합하여 유비퀴틴화를 촉진시킴으로써 라스가 프로테아좀(세포내 단백질 분해장소)으로 이동해 분해되어 없어져 암 유발이 억제된다는 사실을 밝혀냈습니다.

향후 이 원리를 활용해 라스를 분해하여 인체에 흡수가 잘 되는 저분자 항암제를 개발할 수 있을 것으로 기대받고 있습니다.

이번 연구는 최강열 교수가 주도하고 윤종복, 김호근 교수 및 정우정, 윤주용 박사과정생이 참여했습니다.

연구결과는 사이언스지의 자매지인 세포신호전달분야 '사이언스 시그널링(Science Signaling)'에 4월 10일자로 게재되었습니다.
(논문명: Ras Stabilization Through Aberrant Activation of Wnt/beta-catenin Signaling Promotes Intestinal Tumorigenesis)


<연 구 개 요>

Ras Stabilization Through Aberrant Activation of Wnt/beta-catenin Signaling Promotes Intestinal Tumorigenesis Jeong, W.J. et al. (Science Signaling - 2012. 4.10)

라스(Ras)는 21 킬로달톤(KDa) 크기의 작은 지(G)-단백질들의 그룹에 속하며, 포유동물에서 K-, N-, H-Ras의 세 종류가 대표적인 것들로 알려져 있다. 라스가 처음으로 밝혀진 이후 30년의 세월이 지났지만, 라스는 여전히 암과 관련하여 가장 중요한 연구개발 대상으로 남아있다.
라스는 세포성장을 조절하는 중요한 단백질로 아랫단계인 어크(ERK) 및 PI3 kinase-Akt 신호전달계들을 한꺼번에 조절할 수 있는 신호전달의 스위치적인 역할을 수행한다. 정상적인 상황에서는 윗 단계로부터 유입되는 상피세포성장인자(EGF)와 같은 세포성장신호에 여부에 따라 GDP 혹은 GTP가 결합함으로 인해 불활성화 혹은 활성화 상태로 전환되며 신호전달을 조절한다(그림 1).

 

그림 1. 라스는 GDP가 결합된 불활성화 상태로 존재하다가 윗 단계에서 EGF와 같은 세포 성장 신호를 받게 되면 GDP가 GTP로 치환되어 Ras-GTP 형태가 되어 활성화된다.  활성화된 Ras-GTP는 가수분해작용에 의해 Ras-GTP 형태로 돌아와 불활성화 되며 이 같은 구조변경을 통하여 세포성장 조절에 중요한 스위치적인 역할을 한다.

라스가 세포성장 신호를 전달하는 기능을 수행하기 위해서는 세포막에 존재해야만 하는데, 파네실트란스퍼라제(Farnesyltransferase)라는 효소가 파네실화시켜서 라스를 기능을 수행하는 세포막으로 옮겨지도록 한다

 

그림 2. 라스 단백질이 기능을 수행하기 위해서는, 세포질에서 만들어진 이후 세포막으로 이동해야 하는데, 이를 위해서는 파네실트란스퍼라제(Farnesyltransferase)같은 효소에 의해 파네실화(그림에서 갈색 선들)가 일어나야만 세포막을 존재할 수 있게 되며, 이때 GTP가 결합한 형태의 활성화된 라스가 아랫단계로 신호를 전달한다.

라스유전자에 돌연변이가 일어난 암환자들에서는 라스가 항상 GTP가 붙는 비정상적으로 활성화되어있는 형태로 만들어지며, 이 경우 GDP가 붙은 불활성화 상태로 돌아가지 못해 아랫단계로 항상 세포성장 신호를 보내는 결과가 되어 암 발생에 기여한다.  
  
이번 최강열 교수 연구진의 연구는 윈트(Wnt)라는 또 다른 세포성장 신호전달계를 통해 라스단백질이 분해될 수 있음을 밝혔으며, 이 때문에 돌연변이에 의해 GTP가 붙은 활성화형태의 라스가 만들어진다 해도, 분해되어 없어지기 때문에 암이 생기지 않음을 밝혔다.
이 연구는 수많은 연구자들이 지금까지 연구해온 라스라는 중요 단백질이 단백질분해수준에서 조절될 수 있음을 보여준 최초의 연구라는데 중요성이 있다고 하겠다.
더욱이 이 같은 조절이 사람과 동물의 암 발생에 중요한 역할을 수행한다는 것을 환자샘플과 모델동물을 이용해 확인했다. 새로운 라스분해 원리를 요약하면, 윈트신호전달이 낮게 유지되는 상황에서 (예로서 윈트신호전달계의 신호억제 인자들인 Apc 혹은 Axin가 과발현 등으로 기능을 잘 수행할 경우) GSK3b라는 인산화효소가 활성상태가 되어 트레오닌(Thr)-144, 와 Thr-148 번을 인산화 시킨다. 
이같이 인산화된 라스는 베타티알시피(b-TrCP)-E3-ligase 라는 단백질 분해에 관련되는 물질복합체가 결합할 수 있고, 이를 통해 라스는 유비퀴틴화 되어 26S 프로테아좀에 시스템에 의해 분해된다. 

 

그림 3.  (+) 혹은 (-) Wnt 신호에 따른 라스 단백질의 분해 조절 메커니즘

그림 4. 라스 단백질이 윈트신호전달계를 저해하는 효소인 GSK3b에 의해 트레오닌-144(Thr-144)와 Thr-148 번의 아미노산 잔기들에 인산화 됨을 직접적인 인산화 실험을 통해 입증함.  라스의 인산화는 LC-MS/MS 분석방법으로 밝혔다.

그림 5. 라스가 인산화 되는 아미노산들인 Thr-144 와 Thr-148에 돌연변이를 유도한 돌연변이형 라스들을 이용해, 이들 아미노산 잔기들의 인산화가 유비퀴틴화를 통한 라스 분해에 중요함을 보여주는 데이터임.

암을 유발할 수 있는 형태(GTP결합)의 활성화된 라스의 경우, APC의 돌연변이같은 비정상적인 윈트신호에 의해 분해되지 않고 축적되면, 비정상적인 세포성장을 유도하여 암이 유발될 수 있다.
보통의 경우에는 돌연변이가 일어난 형태의 라스가 많이 만들어 진다고 하더라고 분해되어 암 발생을 유도하지 않으나, APC의 돌연변이에 의해서, 윈트신호가 활성화된 경우에는, 돌연변이가 일어난 GTP-Ras가 분해되지 않고 많이 축적되게 되어 아랫단계에 비정상적으로 세포성장 신호를 보내어 암을 발생시킴을 암환자와 동물모델을 통해 확인되었다.

 

그림. 6. APC의 돌연변이에 의해 윈트 신호전달계가 활성화됨에 따라 라스가 증가된 마우스에서 암이 발생된 경우를 보여주는 데이터임. ApcMin/+과 Apc1638N 두 종류의 APC가 돌연변이된 마우스를 사용했으며, 라스의 활성화가 아랫단계의 ERK와 전사인자인 ATF까지 활성화시킴을 보여주고 있다. 이 경우 APC의 돌연변이에 의해 윈트신호전달계가 활성화 되었을 때 라스의 분해를 예측하게 하는 인산화형태의 라스(p-Ras)는 반대로 줄어듦을 보여줌으로써, 라스의 인산화 억제 때문에 라스 단백질의 양이 증가됨을 암시하고 있다.

이 같은 동물수준에서의 윈트신호에 의한 라스안정성 조절이 사람의 암 발생에서도 중요함을 사람의 대장암샘플을 이용하여 확인하였다.

이 경우 사람의 APC가 유전적으로 돌연변이가 일어난 FAP (familial type adenomatos polyposis coli) 환자샘플을 이용하여, 라스의 인산화 및 양적 상태를 윈트신호전달계 활성화 상황과 비교하여 보여주었다.

그림 7. APC가 돌연변이가 있는 가족력을 가진 환자(FAP; familial type adenomatos polyposis coli-사진 좌측아래)의 대장암 조직에서 윈트 신호전달계 활성화 마커인 베타카테닌(b-catenin)과 라스가 동시에 증가되나 인산화가 일어난 라스는 반대로 감소함을 보여주는 결과다. 오른쪽 그림은 다양한 암 진행 상태에서 베타카테닌과 라스가 비례적으로 증가하나, p-Ras는 감소함을 보여 준다.


-오늘날 라스를 타깃으로 하는 항암제 개발의 한계점- 

대장암을 비롯한 대부분의 암에서는 활성화 형태의 라스돌연변이가 매우 높은 비율로 발견되고 있으며(대장암에서는 30-50%, 췌장암에서는 90%), 이 같은 돌연변이는 결합된 GTP가 가수분해 될 수 없는 활성화형태로서 지속적으로 세포성장신호를 보내기 때문에 암이 발생하는데 기여한다.
라스가 암 발생, 특히 진행에 가장 중요한 원인인 것이 잘 밝혀진 이유로 해서, 활성화된 라스를 제어하는 항암제 개발은 라스와 암과 관련성이 발견된 이후, 수많은 암연구자들은 물론 제약회사에서 크게 관심을 가져왔다.
대표적인 라스 제어 항암제 개발방법으로 시도된 것은 뉴클레오타이드 유사물질을 이용하여, 활성화된 GTP-Ras에서 라스를 떼어내려는 시도를 하였으나, GTP-Ras간의 결합력이 워낙 강해 GTP의 결합을 못하게 하는 유사물질 개발은 대부분이 실패했다.
또한 라스에 결합하여 그 활성을 억제하는 저분자화합물을 개발하려는 시도도 라스단백질의 구조상 저분자 화합물이 달라붙을 수 있는 공간이 마땅하지 않아 (그림 8) 이에 대한 연구개발도 대부분 실패로 끝났다. 

 

그림 8. 라스는 GTP(붉은색)가 높은 친화력을 가지고 달라붙어있고, 또한 구조적으로 저분자 화합물이 붙기 힘든 구조를 취하고 있다.

앞서 설명한 바와 같이 라스가 기능을 수행하기 위해서는 작용하는 장소인 세포막으로 위치 이동되는 것이 매우 중요하다. 따라서 라스가 세포막으로 이동하는데 필요한 파네실화(Fanesylation)를 억제하는 파네실트랜스퍼라제 저해제(Farnesyltransferase inhibitor; FTI)는 지난 20년간 수많은 암 연구자들과 제약회사들에 의해서 항암제 개발이 시도되었다.
하지만 이 저해제에 의해서 라스의 파네실레이션이 억제되어도 저라닐저라닐레이션(Geranylgeranylation)이라는 부수적인 지질화에 의해서 여전히 세포막으로 이동할 수 있음이 밝혀졌다.
따라서 파네실트렌스퍼라제 저해제 항암제개발에 제동이 걸렸으며, 이와 더불어 효과나 안정성 부작용 등의 문제가 밝혀짐으로써, 현재로서는 많은 연구자의 경우 라스를 직접 조절 할 수 있는 항암제 개발은 실패로 끝났다! 라고 판단하는 상황에 있다.
하지만 라스를 직접 제어하는 항암제 개발의 중요성에 대해서는 아직 모두 인정하고 있는 상황이다. 오늘날 많이 사용되기 시작했으며, 2017년까지 판매가 급증 하리라 예상되고 있는 차세대의 항암제로 알려진 상피세포성장인자수용체(EGFR) 작용하는 특이적인 상피세포성장인자 수용체 단클론항체항암제(EGFR mAb)들이 K-Ras에 돌연변이가 있는 환자에서 효과가 없음이 밝혀짐으로서 라스를 직접 제어하는 항암제 필요성은 그 어느 때 보다 더욱 절실 하다고 하겠다.

-연구 의의-

라스를 분해시키는 메커니즘을 밝힌 이번 연구결과는 돌연변이가 일어나 활성화된 라스를 가지는 암환자를 치료할 수 있는 한계극복용 라스제어 화합물 항암제를 개발하기 위한 초석이 될 전망이다.
최강열 교수 연구진은 현재 연구를 통해 라스를 분해하는 저분자화합물을 화합물라이브러리 스크리닝을 통해 발굴하였고, 종양저해 효과를 확인하였으며, 같은 대학의 한균희 교수와 공동으로, 유사화합물들을 합성하여 약효가 증진되고 안정성 있는 항암제로 개량하는 연구를 진행하고 있다.
이들 화합물항암제들은 돌연변이에 의해 활성화된 라스를 분해하는 혁신적인 항암제로 개발될 수 있을 전망이다. 이 저분자 라스분해 항암제는 파네실트란스퍼라제 항암제들의 개발이 실패로 돌아간 상황에서 직접적으로 라스를 제어하는 한계 극복형 항암제가 될 전망이다.
특히 이 화합물들은 라스에 직접 작용하기 때문에, 상피세포수용체(EGFR) 단클론항체항암제들에 효과를 보지 못하는 K-Ras 돌연변이 환자들의 치료에 적용할 수 있는 한계극복용 항암제가 될 전망이다.
마지막으로 라스의 경우 ERK 신호전달계는 물론, 라스가 조절하는 것으로 알려진 암 발생과 관련된 또 하나의 중요 신호전달계인 PI3 kinase-Akt 신호전달계를 조절하기 때문에 오늘날 항암제의 개발 방향인 이상적인 다중타겟항암제가 될 전망이다.
실제 2012년 현재 많은 연구자들이 ERK와 PK3 kinase-Akt 신호전달계를 각각의 신호전달계들을 저해하는 항암제들이 함께 처리했을 때(combinatory therapy시) 항암효과가 뛰어남이 관찰되었는데, 연구진이 개발하고 있는 라스분해 항암제의 경우는 단일 화합물로 이들 주요 신호전달계들을 동시에 제어할 수 있는 이상적인 항암제가 될 전망이다.


 용  어  설  명

윈트(Wnt) 신호 :
암세포의 성장과 전이의 대표적인 작동경로

유비퀴틴(Ubiquitin) :
76개 아미노산으로 구성된 단백질로 매우 작고, 다른 단백질과 결합해 분해를 촉진함

Ras (라스) :
표피세포성장인자(EGFR; epidermal growth factor receptor)등으로부터 시작된 세포성장신호를 조절하는 스위치 역할을 하는 21 kDa의 작은 단백질이며(종종 small G protein family라 불리고 일반적으로는 K-, N-, H-Ras가 대표적임), GTP-와 GDP가 결합하여 활성화 불활성화 되며, Raf-MEK-ERK와 PI3 kinase-Akt 신호전달계들을 조절할 수 있다.

Farnesyl transtransferase inhibitor (파네실트란스퍼라제 억제제) : 
라스 신호전달계에서 라스가 세포막으로 이동하는데 필요한 파네실화(farnesylation)를 방해하여 라스에 의한 신호전달을 차단하여 암 발생을 저해하는 항암제로 개발되어 왔으나 제한적인 약효와 독성, 부작용 등으로 항암제로서 개발이 중단된 상황이 많다.  
 
얼비툭스/시툭시매브[Erbitux/Cetuximab) :
상피세포성장인자(EGFR; epidermal growth factor receptor)에 작용하여 EGFR의 기능을 억제하는 단클론항체항암제로, 전이성대장암을 비롯한 몇몇 암에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 

Adenomatos polyposis coli (APC) :
윈트신호의 저해인자로 작용하는 인자로 암이 시작되는 것을 억제하는 인자로 작용하며, 대장암 환자들에서 90%의 높은 비율로 돌연변이가 발견되며, 이 돌연변이는 암 발생에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 

Familial type adenomatos polyposis coli (FAP) :
가족력으로 Apc(adenomatous polyposis coli) 유전자에 이상이 생긴 암환자로, 젊은 시기인 20-30세에 발병하며 대장에 수많은 폴립이 발생된다

 

<최강열 교수>

1. 인적사항                          

 ○ 성 명 : 최강열  
 ○ 소 속 : 연세대학교 생명시스템대학 생명공학과  단백질기능제어이행연구센터(ERC) 

2. 학력사항
  1978.2 - 1985.2   연세대학교  생명공학 학사   
  1988.8 - 1993.8  퍼듀대학교  생화학/생명과학 박사 
    
3. 경력사항 
  1993.9 - 1995.2     하버드 의과대학 생화학-분자약리학 박사후연구원
  1995.2 - 2001.8    연세의대 생화학-분자생물학교실 조/부교수
  2001.8 - 2004.8   연세대학교 공과대학 생명공학과 부교수
  2004.9 - 현재  연세대학교 생명시스템대학 생명공학과 교수
  2006.3 - 2007.2  연세대 유전체 협동과정 주임교수
  2003.1 - 현재  Experimental and Molecular Medicine, Editor
  2009.1 - 현재  Journal of Biochemistry, Associate Editor
  2007.1 - 현재  The Open Chemical and
    Biomedical methods Journal, Editorial Board
  2009.1 - 현재  World Journal of Stem Cells,  Editorial Board
  2009.9-2010.7         연세대 생명공학과 학과장
  2005.3 - 2009.8  국가지정연구실(NRL) 책임자
  2009.2 - 현재  단백질기능제어이행연구센터(ERC) 센터장 

4. 주요성과 

Woo-Jeong Jeong, Juyong Yoon, Jong-Chan Park,Soung-Hoon Lee, Seung-Hoon Lee, Saluja Kaduwal Hoguen Kim, Jong-Bok Yoon,  Kang-Yell Choi. 2012. Ras Stabilization Through Aberrant Activation of Wnt/beta-Catenin Signaling Promotes Intestinal Tumorigenesis. Science Signaling. 5, 1-14.

Byung-San Moon, Hyun Yi Kim, Mi-Yeon Kim, Dong-Hwa Yang, Jong-Min Lee, Kyung-Won Cho, Han-Sung Jung, and Kang-Yell Choi. 2011. Sur8/Shoc2 Involves Both Inhibition of Differentiation and Maintenance of Self-renewal of Neural Progenitor Cells via Modulation of ERK Signaling. Stem Cells. 29, 320-331

Ju-Yong Yoon, Kyoung-Hwa Koo, and Kang-Yell Choi. 2011. MEK1/2 Inhibitors, AS703026 and AZD6244, may be potential therapies for K-rasMutatedColorectalCancerthatisresistantto EGFR Monoclonal Antibody Therapy. Cancer Research. 71:445-453.

Dong-Hwa Yang, Ju-Young Yoon, Soung-Hoon Lee, Vitezslav Bryja, Emma R. Andersson, Ernest Arenas, Young-Guen Kwon, Kang-Yell Choi. 2009. Wnt5a is Required for Endothelial Differentiation of Embryonic Stem Cells and Vascularization via Pathways Involving Both Wnt/Beta-Catenin and PKCa. Circulation Research. 104, 372-379.

Sung-Eun Kim , Ju-Yong Yoon, Woo-Jeong Jeong, Soung-Hoo Jeon, Yoon Park, Jong-Bok Yoon ,Young Nyun Park, Hoguen Kim, and Kang-Yell Choi. 2009. H-Ras is degraded by Wnt/b-catenin signaling via b-TrCP-mediated polyubiquitination. Journal of Cell Science. 122, 842-848. (Cover paper/highlight paper)

Kang-Yell Choi., D. M. Lyons, and E. A. Elion. (1994). Ste5 thether multiple protein kinase in the MAP kinase cascade required for mating in Saccharomyces cerevisiae. Cell. 78, 499-512.

  

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