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대장암은 세계적으로 가장 많이 발병하는 암 중 하나로, 우리나라도 대장암 발병률이 세계 4위, 아시아 1위로 매우 높습니다.

대장암의 주요 사망원인은 암세포의 간 전이로, 대장암 환자 10명 중 2~7명에서 간전이가 발생합니다.

암이 간으로 전이되면 수술이나 화학적 항암요법 등의 치료가 매우 제한적이고, 치료되었다 해도 재발되기 쉽기 때문에 대장암 환자의 간 전이를 근본적으로 억제하는 것은 매우 시급한 사항입니다.

지금까지는 암 표지인자 중 하나인 암태아성항원(CEA)이 과도하게 발현되면 대장암 세포의 간전이를 촉진하는 것으로 알려졌습니다.

그러나 CEA가 어떻게 간전이에 관여하는지 그 원리는 명확히 규명되지 못했고, CEA를 표적으로 한 효과적인 간전이 억제제도 없는 상황입니다.

- CEA 표적 핵산 앱타머에 의한 대장암의 간전이 억제화 기전 -

대장암 세포로부터 발현되는 CEA는 Kupffer 세포 표면의 CEA 수용체인 hnRNP M4와 결합하여 여러 싸이토카인의 분비를 유도, 간조직 내 혈관내피세포에 염증반응을 유발하고 다양한 세포접합 단백질 발현을 증가시켜 암전이 과정이 촉진된다. 또한 CEA는 대장암 세포 표면의 DR5와 직접적으로 결합함으로써, 대장암 세포의 anoikis 과정을 저해하여 혈액 상에 돌아다니는 대장암 세포의 생존률을 증가, 암세포가 전이화 될 수 있는 세포로의 전환을 유도한다.
 본 연구로부터 개발한 핵산 앱타머는 CEA의 'PELPK' 부위와 결합하여 CEA의 기능을 blocking 함으로써 CEA에 의한 암전이 과정의 개시단계를 저해하고, 암세포의 전이화되는 환경을 원천적으로 봉쇄함으로써 효과적으로 암전이를 억제한다. 

단국대 이성욱 교수팀이 대장암 환자의 주요 사망원인인 암세포의 간 전이를 효과적으로 해결할 수 있는 새로운 물질 '핵산 앱타머'를 개발했습니다.

핵산 앱타머는 새로운 개념의 생고분자 물질로, 항체와 같이 표적분자에 높은 친화력과 특이성을 갖고 결합할 수 있는 단선으로 구성된 핵산입니다.

이성욱 교수팀은 CEA의 특정부위(N 말단 부위의 PELPK 아미노산 서열)가 대장암의 간 전이에 중요한 역할을 하는 것에 주목하고 이 부위에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머(aptamer)를 개발, 쥐 실험을 통해 대장암 세포가 간으로 전이되는 첫 단계에서 효과적으로 억제할 수 있음을 규명했습니다.

또 이 앱타머가 대장암 세포의 생존력에 관여하는 CEA와 세포사멸 수용체간의 결합을 방해하여 효과적으로 대장암세포의 사멸을 유도한다는 사실을 밝혔습니다.

개발된 앱타머는 CEA 단백질뿐만 아니라 CEA 발현 대장암 세포표면에 특이하게 결합하는 것을 확인함으로써, 앱타머를 활용해 대장암 세포의 간전이를 진단 추적하며 동시에 치료할 수 있는 가능성도 제시했습니다.

이 교수팀이 발굴한 핵산 앱타머는 저분자 화학약품과 같이 화학적으로 균일하게 대량 합성할 수 있고, 여러 목적에 맞게 변형할 수 있으며, 염증유발이나 독성도 거의 없습니다.

특히 암조직에 쉽게 침투하여 기존 의약품의 한계를 극복할 수 있는 새로운 차세대 의약제제로 평가 받고 있습니다. 

이번 연구성과는 CEA의 특정부위가 대장암의 간전이를 촉진하는 주요인자임을 규명하고, 이 CEA 특정부위를 표적으로 하는 핵산앱타머 개발을 통해 대장암 세포가 간으로 전이되는 과정을 원천봉쇄하여 이에 따른 사망률을 낮출 수 있는 계기가 될 전망입니다.

이번 연구는 단국대 이성욱 교수가 주도하고, 이영주 박사, 한승렬 박사과정생, 김남연 연구원과  아산병원 이수한 박사, 동아의대 정진숙 교수 등이 참여했습니다.

연구결과는 소화기학 분야의 권위 있는 학술지인 '소화기병학(Gastroenterology)'지 7월 1일자에 게재되었습니다.
(논문명: An RNA aptamer that binds carcinoembryonic antigen inhibits hepatic metastasis of colon cancer cells in mice)

<연 구 개 요>

An RNA aptamer that binds carcinoembryonic antigen inhibits hepatic metastasis of colon cancer cells in mice
Lee, Y.J., Han, S.R., Kim, N.Y., Lee, S.H., Jeong, J.S., and Lee, S.W. 
(Gastroenterology 2012; 143: 155-165 - 2012. 7. 1 출판)

○ 암태아성 항원과 대장암의 간전이
 암태아성 항원 (Carcinoembryonic antigen, CEA, CEACAM5, 또는 CD66e)은 약 180-200 kD의 분자량을 가진 당단백질로서 GPI를 통해 세포 표면에 부착되거나 또는 phospho-inositol 특이적인 phospholipases C/D에 의해 탈착되어 세포 밖으로 분비된다. 대장암세포에서의 CEA 과발현은 암세포간의 이동, 세포접합 및 침윤과정과 간으로의 암전이 촉진과 연관되어 있다.
 특히 CEA의 N 말단 부위의 N과 A1 도메인 사이에 존재하는 'PELPK' 아미노산 서열이 간조직에 존재하는 macrophage인 Kupffer 세포 표면에 존재하는 수용체인 hnRNP M4에 인식된 후 Kupffer cell을 활성화함으로써, IL-1, IL-6, IL-10 및 TNF-a 등 여러 cytokine의 분비를 유발, 염증반응을 유도한다. 또한 간조직 내 혈관내피세포 (hepatic sinusoidal endothelial cell) 표면에 E-selectin, VCAM-1 및 ICAM-1 등의 여러 세포 접합단백질들의 발현을 유도함으로써 간전이의 환경이 조성될 것으로 제시되고 있다. 이러한 세포 접합물질과 CEA를 과발현하는 대장암세포 간의 접합 후 암세포는 내피세포를 투과하여 간조직 내로 침윤과정을 수행할 것이다.

대장암의 간 전이과정 모식도. CEA의 붉은 색 부위가 ‘PELPK' 서열이다


또한 활성화된 Kupffer cell로부터의 cytokine은 iNOS를 방해하여 toxic한 NO와 ROS 생성을 저해함으로써 간조직에 포착된 암세포의 생존률을 높여준다. 즉 CEA와 hnRNP M4 간의 결합을 통한 kupffer cell의 활성화가 CEA의 간전이에서의 주요 기능이라 할 수 있다.
 정상 세포는 조직으로부터 이탈되는 경우 'anoikis'라는 세포사멸 과정을 겪는다. 그러나 대장암 세포 표면에 CEA가 과발현시에는 anoikis가 억제되어 암세포가 원조직으로부터 이탈이 되어도 살아남으로써 간 등의 타 조직으로의 이동이 가능한 세포로 전환되는데, 이는 CEA의 'PELPK' 서열이 TRAIL 수용체인 death receptor 5 (DR5)와 직접적인 결합을 통해 TRAIL 신호전달 체계를 방해함으로써 유발될 것으로 예상되고 있다.

○ 암태아성 항원의 'PELPK' 특이적 핵산 앱타머 발굴
 CEA에 대한 항체 연구는 이미 많은 그룹에서 진행되었으나 CEA의 'PELPK' 부위를 특이적으로 인식하는 리간드의 발굴은 되어 있지 않으며, 이에 상기 부위가 과연 간전이 유도의 주요인자인지 개체 수준에서의 검증연구는 되어 있지 않았다. 본 연구에서는 처음으로 CEA의 'PELPK' 부위만을 특이적으로 표적하는 리간드를 개발함으로써, 상기 부위가 간전이의 주요 인자임을 밝혀내고자 하였으며 더불어 간전이를 효과적으로 저해할 수 있는 제제를 개발하고자 하였다.
  CEA 항체의 경우 암조직으로의 침윤도가 좋지 않으며, 특히 고친화도의 항체의 경우는 오히려 생체 내의 혈관을 따라 떠돌아다니는 항원에 의해 빠르게 clear 되기에 치료제/진단제로서 한계점을 갖고 있다. 본 연구에서는 이를 극복하기 위하여, 화학적 대량합성 및 유도체 개발이 용이하며 암조직 내로의 침윤성이 뛰어나 차세대 항암제로서의 잠재력이 큰 핵산 앱타머(aptamer)를 발굴하였다.

CEA ‘PELPK' 특이적인 앱타머 발굴 및 특성. Counter SELEX 방법 개요(A) 및 선별된 앱타머의 2차 및 3차 구조 예측도(B). 앱타머에 의한 CEA와 CEA 세포 표면 수용체인 hnRNP M4의 결합 억제 모식도(C) 및 결합 억제율(D). 앱타머를 이용한 CEA 발현세포 표면 특이적 면역염색(E).


 Counter-SELEX 기법을 활용, CEA의 'PELPK' 부위에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 (pyrimidine nucleotide의 2'이 fluoro로 치환된 RNA로 구성)를 발굴하였다. 앱타머의 화학합성을 위해, 그 size를 소형화하였으며 stem-loop 형태의 구조를 갖고 있어 loop 부위가 CEA와 결합하는 부위임을 밝혔다 (그림 2B). 소형화한 앱타머는 예상과 같이 CEA와 CEA 수용체인 hnRNP M4 간의 결합을 억제하였으며 (그림 2C, 2D), CEA를 발현하는 세포 표면에 특이적으로 결합할 수 있었다.

○ 핵산 앱타머에 의한 효과적인 대장암의 간전이 억제
 발굴한 앱타머는 암세포간의 이동 (migration), 동종세포 응집 (homotypic cell aggregation) 및 암 침윤과정 (invasion) 등 간으로의 전이와 관련 있는 여러 세포 현상을 억제하였다.

앱타머에 의한 CEA+ 세포 특이적 세포 이동(migration)(A), 동종세포응집(homotypic cell aggregation) 반응(B) 및 침윤(invasion) 과정(C) 저해.


이는 곧 상기 세포 현상에 CEA의 'PELPK' 부위가 관여함을 시사한다. 주목할 점은 앱타머에 의해 CEA를 발현하는 대장암 세포의 anoikis가 효과적으로 유도되는데, 이는 앱타머가 CEA와 DR5 단백질간의 결합을 직접적으로 저해함으로써 기인한다는 것을 확인하였다.

앱타머에 의한 대장암 세포의 anoikis 유도. CEA에 의한 anoikis 저항 기전과 앱타머의 작용 기전 모식도(A) 및 앱타머에 의한 anoikis 신호전달 과정의 중간 매개체인 caspase 8의 활성 증가(B). 앱타머에 의한 세포 내(C,E) 및 실험관(D)에서의 CEA와 DR5 간의 직접적 상호작용 억제.


따라서 CEA의 'PELPK' 부위가 DR5와 직접 결합하는 부위임이 검증되었고 이러한 두 단백질 간의 결합이 CEA 발현 대장암세포의 anoikis를 방해하는 주요 인자임이 확인되었다.
 상기 연구 결과들은 발굴한 앱타머가 CEA와 hnRNP M4 및 CEA와 DR5 간의 결합을 모두 방해함으로써 CEA에 의한 간전이 개시과정을 방해하고, CEA 암세포의 세포 사멸을 유도하여 대장암의 간전이 현상을 효과적으로 억제할 수 있는 가능성을 시사한다. 이를 검증하기 위해 대장암의 간전이 동물모델(마우스)에서의 개체 실험을 수행하였다. 우선 앱타머의 약물로서의 안정성 및 생체 내의 효용성을 증대시키기 위해 앱타머의 5' 말단에 polyethylene glycol이 부착된 유도체를 합성하였고, 생동성 분석을 통해 앱타머의 생체 내 안정성이 증가됨을 확인하였다.

Polyethylene glycol을 부착한 앱타머의 생동성 분석(A) 및 간전이 동물모델에서의 앱타머에 의한 대장암 세포의 간전이 억제(B).


CEA 발현 대장암세포를 마우스의 비장 내로 투입함으로써 간으로 전이된 동물모델을 구축하였고, 이러한 동물모델에 합성한 앱타머 유도체를 투입한 결과 대조군 대비 91% 이상 대장암의 간으로의 전이가 특이적이며 효율적으로 간독성 없이 억제됨을 확인하였다 (그림 5B).
 본 연구를 통해 CEA의 'PELPK' 부위가 대장암의 간전이를 촉진하는 주요인자임을 개체 내에서 증명하였으며, 개발한 핵산 앱타머는 CEA의 'PELPK' 서열이 포함된 특정영역에 특이적으로 결합하여 대장암의 가장 큰 사망원인인 간전이 과정을 원천적으로 봉쇄함으로써, 효율적이며 특이적인 전이억제제 나아가 항암치료제로서 활용될 수 있을 것이다. 동시에 발굴된 앱타머는 혈중의 항원의 변화 및 간전이화 가능성 있는 암세포를 측정하고 추적할 수 있는 진단소자 및 CEA에 의한 암전이 과정을 이해하는 도구로서도 활용될 수 있다는 데에 큰 의미가 있다.

 

 용  어  설  명

암태아성항원(Carcinoembryonic antigen, CEA) :
약 180-200 kD의 분자량을 가진 당단백질로 대장암 수술 후 예후 판단인자로 활용되고 있음.

핵산 앱타머(aptamer) 
마치 항체와 같이 표적분자에 높은 친화력과 특이성을 갖고 결합할 수 있는 단선으로 구성된 핵산 (DNA, RNA, 변형핵산)으로, 라이브러리 스크리닝을 통하여 발굴될 수 있는 새로운 개념의 생고분자 물질이다. 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 앱타머 발굴이 가능하고, 저분자 화학약품과 같이 화학적으로 균질의 대량 합성이 가능하고 여러 목적에 맞게 변형이 용이하며, 염증유발이나 독성이 거의 없으며, 암조직으로의 침윤성이 뛰어나 기존 의약품의 한계를 극복할 수 있는 새로운 차세대 의약제제로서 각광을 받고 있다.

암태아성항원(CEA)
약 180-200 kD의 분자량을 가진 당단백질로서 GPI (glycosyl-phosphatidylinositol)를 통해 세포 표면에 부착되거나 또는 phospho-inositol 특이적인 phospholipases C/D에 의해 탈착되어 세포 밖으로 분비된다. 암표지인자 특히 대장암 수술 후 예후 판단 인자로 활용되고 있으며, 대장암세포에서의 CEA 과발현은 암세포간의 이동, 세포접합 및 침윤과정과 간으로의 암전이 촉진과 연관되어 있다고 알려져 있다.
 
PELPK
CEA의 N 말단 부위의 N과 A1 도메인 사이에 존재하는 Proline-lutamate- eucine-Proline-Lysine 아미노산 서열을 지칭한다.

SELEX (Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment)
단선의 DNA, RNA 또는 변형 nucleotide로 구성된 핵산 앱타머를 선별하는 방법으로 1990년 Colorado 대학의 Larry Gold 박사가 처음 개발하였다. 무작위의 염기서열로 구성된 핵산 라이브러리부터 표적 분자와 결합할 수 있는 핵산 서열을 선별하는 방법으로서, 초기에는 RNA 결합 단백질에 결합하는 특정 RNA 서열을 찾기 위한 방법으로 제안되었다. 그러나 앱타머가 서열에 따른 특정 3차 구조 형성에 의해 다양한 분자와 결합할 수 있다는 사실이 밝혀진 이후, 현재는 핵산과 결합하는 단백질 이외에도 자연상태에서는 핵산과 결합하지 않는 단백질, 탄수화물, 지질, 당단백질 더 나아가서는 호르몬, 펩타이드, 소분자 화합물질, 이온 등 다양한 표적에 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 찾을 수 있다. 특히 핵산은 실험관에서 증폭될 수 있다는 특성을 이용함으로써, 단기간 내에 몇 번의 반복 cycle을 통해 우리가 원하는 특정 표적에 대한 앱타머를 실험관 내에서 발굴할 수 있다.  최근에는 정제된 표적 분자가 아닌 세포 자체 또는 생체 내의 조직 자체를 표적으로 한 핵산 앱타머 발굴, 세포 및 조직 내로 투과될 수 있는 앱타머 발굴 등 다양한 목적과 기능을 가진 앱타머 개발로 적용되고 있다.

소화기병학(Gastroenterology)지
소화기질환 및 간질환 분야의 기초부터 중개연구 및 임상 연구 관련 논문 등 관련 전 분야를 출판하며, 미국소화기학회 (American Gastroenterological Association)에서 공식 발간하는 세계적으로 권위 있는 학술지이다. 특히 피인용지수(Impact Factor)가 2010년 기준 12.032로서, 과학 분야에서 상위 1.3% 이내에 랭크되며 소화기학 및 간장학 (gastroenterology 및 hepatology) 분야의 72개 SCI 급 저널 중 1위에 랭크되는 학술지이다.
 

이성욱 교수 이력사항


1. 인적사항                          
 ○ 성 명 : 이성욱 (49세) 
 ○ 소 속 : 단국대학교 분자생물학과
 ○ 전 화 : 031-8005-3195
 ○ e-mail : SWL0208@dankook.ac.kr

2. 학력사항
  1981.3 - 1985.2   서울대학교 미생물학과 학사   
  1985.3 - 1987.2  서울대학교 미생물학과 석사  
  1989.9 - 1995.1  Cornell 대학교 박사 
    
3. 경력사항 
  1994.10 - 1997.1 Duke University Medical Center, Research Associate
  1997.3 - 현재  단국대학교 분자생물학과, 교수
  2004.3 - 2009.6 단국대학교 부설 나오센서바이오텍연구소, 소장
  2009.5 - 현재 (재)차세대융합기술원, 겸임연구원
  2011.6 - 현재 한국핵산학회, 회장
  2011.6 - 현재  Nucleic Acid Therapeutics (Official Journal of      Oligonucleotides Therapeutics Society), Editorial Board     Member
  2012.1 - 현재  Molecular Therapy-Nucleic Acids (Published by American    Society of Gene & Cell Therapy, Nature Publishing     Group), Editorial Board Member

posted by 글쓴이 과학이야기

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NK 세포는 암세포를 제거하는 인체 내 면역세포인데, 암환자에서는 이러한 면역세포들의 활성화가 억제되어 있습니다.

인체 내에서 NK 세포가 암세포를 없애기 위해서는 암세포를 죽이는 퍼포린, 그랜자임을 스스로 생산하고 분비하여야 하는데, 이들 살상인자의 조절기작은 그동안 밝혀지지 않았습니다.

효과적인 암 치료를 위해서는 NK 세포와 같은 면역세포들의 활성을 최적화시키는 방법이 중요합니다.

이에 세계 각국에서는 인체 면역세포를 활용한 항암 세포치료제 개발을 진행 중인데요.

한국생명공학연구원(KRIBB) 면역치료제연구센터 최인표 박사와 김태돈 박사가 항암 면역세포인 NK세포(Natural killer cell: 자연살해세포) 활성에 핵심적 역할을 하는 신규 마이크로RNA(microRNA)를 발굴하고 그 기능을 규명했습니다.

싸이토카인으로 NK세포를 활성시 증가되는 퍼포린, 그랜자임

연구팀은 NK세포의 활성에 가장 중요한 살상 인자인 퍼포린, 그랜자임을 조절하는 새로운 마이크로 RNA인 miR-27a를 찾아내고, miR-27a가 직접 퍼포린, 그랜자임을 조절하고, 나아가 NK세포 활성에 중요한 인자임을 밝혀냈습니다.

연구팀은 NK세포 활성시 조절되는 마이크로 RNA를 알아내고 이들 중 miR-27a가 이들 살상인자를 조절하는 가장 중요한 인자임을 밝혀냈습니다.
 
마이크로 RNA는 세포내에서 단백질 생산의 모체가 되는 메신저 RNA에 직접 결합하여 메신저 RNA에서 단백질 생산을 조절하고, 나아가 메신저 RNA 자체의 분해를 유도하는 작은 크기의 RNA로 알려졌지만, NK세포에서의 역할은 드러나지 않았습니다.

연구팀은 이번 연구에서 발굴한 miR-27a를 NK세포에 투여했을 때 NK세포의 활성이 2배정도 감소하고, miR-27a 저해제를 투여하면 NK세포의 활성이 2배정도 증가함을 관찰했습니다.

miR-27a를 처리시 NK세포에서 퍼포린, 그랜자임의 감소와 NK세포 활성의 감소

또 동물실험에서도 대장암의 증식을 같은 정도로 조절함을 알 수 있었습니다.

이 같은 결과를 통해 발굴한 miR-27a가 NK세포의 활성을 조절하는 중요한 인자임을 증명했습니다.

이번 miR-27a 발굴은 NK세포의 활성을 최적화시키는 방법으로 유용하며, 나아가 T세포 등 다른 면역세포에 응용이 가능하여 암치료에 직접 적용할 수 있는 치료제 개발에 중요한 단서를 제공할 것으로 기대받고 있습니다.

이번 연구결과는 혈액학 분야에서 세계 최고의 권위를 자랑하는 미국혈액학회지인 'Blood' 9월 30일자 온라인 판에 발표됐습니다.
<논문명 : Human microRNA-27a* targets Prf1 and GzmB expression to regulate NK cell cytotoxicity>

한편 이번 연구는 교육과학기술부와 한국연구재단이 추진하는 Global Research Laboratory(GRL) 사업의 지원을 받아 미국 워싱턴 대학의 Greenberg 박사팀과의 공동연구로 진행됐습니다.

동물모델에서 miR-27a*에 의해 증가되는 대장암과 miR-27a* 저해제에 의해 감소되는 대장암의 모습

 용 어 설 명

NK세포 :
면역체계의 최전방을 방어하는 면역세포로 백혈구의 림프구 속에 존재하며 각종 바이러스나 암세포를 공격해 파괴한다. NK세포는 암뿐만 아니라 자가면역질환 등 각종 난치성 질병과 다른 면역세포의 기능조절에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려짐.

퍼포린, 그랜자임 :
NK 세포의 활성에 가장 중요한 인자로서 암세포를 죽이는 역할을 함.

miR-27a :
인체내 NK세포가 암세포를 없애기 위해서는 암세포를 죽이는 퍼포린, 그랜자임을 스스로 생산하고 분비하여야 하는데, 이들의 활성화 조절에 관여하는 가장 중요한 인자임.

미국 혈액학회지 'Blood' :
미국에서 발행되는 혈액학 분야에서 세계 최고의 권위를 자랑하는 학회지(IF값 10.558)

마이크로 RNA :
세포내에서 단백질 생산의 모체가 되는 메신저 RNA에 직접 결합하여 메신저 RNA에서 단백질 생산을 조절하고 나아가 메신저 RNA 자체의 분해를 유도하는 작은 크기의 RNA

T세포 :
흉선에서 유래하는 림프구로 면역에서의 기억능력을 가지며 B세포에 정보를 제공하여 항체 생성을 도울 뿐만 아니라 세포의 면역에 주된 역할을 함.

posted by 글쓴이 과학이야기

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